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　　來自丹麥科技大學(xué)生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)系的研究人員，利用evosep one(30SPD)設(shè)備聯(lián)合Thermo Q‐Exactive HF‐X質(zhì)譜一天就可完成了在TMT技術(shù)當(dāng)中分餾混合的28個組分中GSH蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定，而傳統(tǒng)方法則可能需要兩天或者更長的時間，大大節(jié)約了科研寶貴的時間，鑒定結(jié)果重復(fù)性高。

　　1、題目

　　Characterization of glutathione proteome in CHO cells and its relationship with productivity and cholesterol synthesis

　　2、出處

　　Biotechnology & Bioengineering 雜志(IF：4.530)

　　3、研究機構(gòu)

　　丹麥科技大學(xué)生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)系等。

　　4、研究背景與目的

　　谷胱甘肽(GSH)在維持哺乳動物細胞氧化還原平衡中起著核心作用。以往對CHO細胞系的研究表明谷胱甘肽代謝與無性系生產(chǎn)能力有關(guān)。然而，需要一個深入的研究來理解這種關(guān)系，并潛在地突出細胞工程的新目標。在該研究中，通過調(diào)節(jié)CHO細胞生長代謝過程中谷胱甘肽的含量，具體為改變半胱氨酸在培養(yǎng)基的組成，以及使用丁硫氨酸亞砜亞胺(BSO)直接抑制GCL酶，以進一步闡明谷胱甘肽合成途徑的作用。

　　5、研究方法

　　本文通過改變培養(yǎng)基中半胱氨酸的組成，以及使用丁硫氨酸亞砜亞胺(BSO)直接抑制GCL酶兩種方法調(diào)節(jié)細胞內(nèi)谷胱甘肽水平，進行了氨基酸測定，谷胱甘肽的測定，研究了細胞表型，測量了參與中心碳代謝的代謝產(chǎn)物，并采用TMT技術(shù)結(jié)合evosep one(30 SPD)和Thermo Q‐Exactive HF‐X進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。使用Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific, 2.2版)的TMT報告離子定量和MS Amanda識別算法(Dorfer et al.，2014)對質(zhì)譜進行處理。MS/ MS數(shù)據(jù)根據(jù)UniProtKB 提供的CHO K1蛋白質(zhì)組和Global proteome Machine網(wǎng)站提供的污染物公共外源蛋白庫進行查詢。

　　6、研究結(jié)果

　　圖1 BSO處理對細胞生長、生產(chǎn)力和谷胱甘肽含量的影響

       灰色和藍色分別表示對照和低半胱氨酸培養(yǎng)基。圓圈表示未處理的生物反應(yīng)器，三角形表示經(jīng)過BSO處理的生物反應(yīng)器。紅色虛線表示BSO加入0.5 mM培養(yǎng)基濃度的時間。(a)活細胞濃度(VCC)剖面。(b)上清液中隨時間變化的產(chǎn)物滴度。(c)細胞內(nèi)谷胱甘肽濃度隨時間變化。(d)隨著時間的推移，mAb特定的生產(chǎn)力。

　　結(jié)果表明，在BSO添加后的第3天，CHO細胞系的表型不受GSH消耗的影響。從第6天開始，其生長速率逐漸降低，細胞體積逐漸增大，直到第10天。隨著時間的推移，總谷胱甘肽的增加和特定生產(chǎn)力的增加之間存在相關(guān)性。除產(chǎn)品效價外，兩種處理在生長曲線、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)、代謝物攝取和生產(chǎn)速率方面均無顯著差異。

　　圖2 BSO處理對葡萄糖、乳酸和丙氨酸攝取/分泌率的影響

       灰色和藍色分別表示對照培養(yǎng)基或低半胱氨酸培養(yǎng)基。圓圈表示未處理的生物反應(yīng)器，三角形表示經(jīng)過BSO處理的生物反應(yīng)器。紅色虛線表示BSO加入0.5 mM中濃度時的時間。

　　為了進一步表征GSH的消耗對CHO細胞系代謝的影響，測量了選定代謝物的每日細胞外濃度，并計算了相關(guān)的特定攝取和產(chǎn)生速率。乳酸由BSO處理的細胞產(chǎn)生，并被未處理的細胞消耗。在氨基酸攝取/分泌率方面，丙氨酸是唯一一個在BSO處理中與乳酸表現(xiàn)出相似特性的氨基酸。由于乳酸和丙氨酸可以從丙酮酸中產(chǎn)生，這些特征表明三羧酸(TCA)循環(huán)的失敗或減緩。

圖3 BSO處理下CHO細胞中差異表達蛋白的熱圖

　　表1 BSO處理細胞中膽固醇和三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白的表達

　　圖4 BSO處理細胞中谷胱甘肽代謝相關(guān)蛋白的表達

　　分別在第6天和第10天抽取50′106個細胞，使用TMT標記進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。共63個蛋白對BSO反應(yīng)有差異表達，其中下調(diào)蛋白47個，上調(diào)蛋白16個。與產(chǎn)品效價和細胞內(nèi)谷胱甘肽含量相比，低半胱氨酸培養(yǎng)基處理不影響整體蛋白表達。在第一個聚類中，對照組的蛋白表達在第6天至第10天顯著增加，而BSO條件下的蛋白表達在第10天仍然很低。在BSO處理后的第6天和第10天最大的蛋白質(zhì)簇下調(diào)，這具體包括膽固醇的生物合成、羧酸代謝和線粒體中氨基?；鵷 RNA的生物合成。所有參與膽固醇生物合成的酶均被下調(diào)，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SREBP2也被下調(diào)，與TCA循環(huán)相關(guān)的線粒體蛋白下調(diào)。在最后一組(圖3)中，觀察到了對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，因為這一組包含了大部分BSO上調(diào)的蛋白，包括三個與血紅素代謝相關(guān)的蛋白。在最后描述的兩個聚類中可以找到特異性參與GSH代謝的蛋白質(zhì)。圖4顯示了檢測到的與GSH相關(guān)的蛋白質(zhì)的更多細節(jié)，GSH合成相關(guān)蛋白總體上調(diào)，尤其是谷氨酸半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基和S甲酰GSH水解酶。相比之下，一些參與谷胱甘肽消耗的蛋白質(zhì)，例如用于谷胱甘肽解毒或分解代謝的蛋白質(zhì)，總體上被下調(diào)。

　　7、研究結(jié)論

　　隨著生物過程的推移，細胞內(nèi)谷胱甘肽和效價之間具有相關(guān)性。對BSO處理細胞和未處理細胞之間代謝物攝取/分泌率的分析和蛋白質(zhì)組的比較表明，三羧酸循環(huán)的減緩導(dǎo)致了細胞外環(huán)境中乳酸和丙氨酸的分泌。此外，GSH相關(guān)蛋白質(zhì)組的改變與谷氨酸半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基的上調(diào)和特定的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Mu家族的下調(diào)相適應(yīng)。本研究揭示了BSO對谷胱甘肽的調(diào)節(jié)也影響了脂類的生物合成，特別是在蛋白質(zhì)分泌中起作用的膽固醇。

　　參考文獻

　　Chevallier V, Schoof E M, Malphettes L, et al. Characterization of glutathione proteome in CHO cells and its relationship with productivity and cholesterol synthesis[J]. Biotechnology and bioengineering, 2020, 117(11): 3448-3458.