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一、出處

Journal of Analytical & Pharmaceutical Research

二、介紹

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是生物制藥行業(yè)中，首選的宿主表達(dá)系統(tǒng)。宿主殘余DNA(hrDNA)是一種核酸雜質(zhì)，需要在生物藥物純化中進(jìn)行監(jiān)測(cè)以確保純度和安全性。目前，基于實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)的方法廣泛應(yīng)用于hrDNA的定量，然而，數(shù)字PCR技術(shù)具有更高的檢測(cè)靈敏度和精密度。這里，我們報(bào)告了一種數(shù)字PCR定量方法，在這個(gè)方法中首先用蛋白酶消化蛋白藥物，然后將蛋白酶變性處理，利用特異性的引物探針檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA殘留。在反應(yīng)中加入數(shù)字PCR混合物，數(shù)字PCR反應(yīng)體系被分割入納米級(jí)大小的微反應(yīng)室，隨后進(jìn)行終點(diǎn)PCR，然后分析熒光并計(jì)算出殘留DNA的量。與qPCR方法相比，數(shù)字PCR方法的敏感性提高了檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確度。此外，該方法消除了常規(guī)樣品檢測(cè)中DNA提取步驟和DNA的純度要求。該方法已成功地應(yīng)用于默克公司研發(fā)的幾款生物藥hrDNA定量。

許多治療性蛋白，如單克隆抗體藥物是在CHO細(xì)胞中制造的。蛋白藥物中宿主細(xì)胞雜質(zhì)殘留帶來(lái)的安全問(wèn)題，監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)確定了此類(lèi)雜質(zhì)的可接受水平。因?yàn)樗拗鳉埩鬌NA(hrDNA)的允許限度是每天10ng劑量，大多數(shù)生物藥制造商藥物的接受標(biāo)準(zhǔn)往往設(shè)定為宿主殘留DNA低至每毫克研發(fā)藥物的DNA≤1.0 pg，每天的劑量是未知的。因此，較靈敏的DNA定量的方法，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)，在定量hrDNA時(shí)可以不提取DNA。最近，數(shù)字PCR已經(jīng)被不同的供應(yīng)商作為qPCR的改進(jìn)技術(shù)，用于核酸的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR (dPCR)是一種PCR反應(yīng)技術(shù)混合物被分成數(shù)萬(wàn)個(gè)微反應(yīng)單元進(jìn)行PCR檢測(cè)，以及沒(méi)有使用DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的情況下利用泊松分布確定目標(biāo)濃度，實(shí)現(xiàn)核酸絕對(duì)定量的技術(shù)。

DNA提取會(huì)效率影響PCR的靈敏度。我們建立了一種非常敏感的CHO hrDNA dPCR方法，并且不需要DNA提取，只需要利用蛋白酶消化,搭配已經(jīng)驗(yàn)證的引物和探針，即可實(shí)現(xiàn)hrDNA絕對(duì)定量。與qPCR相比較，數(shù)字PCR具有更低的定量限(LOQ)，在分析范圍內(nèi)具有更高的精密度和準(zhǔn)確度。

三、方法

為了進(jìn)行dPCR，我們準(zhǔn)備了一個(gè)混合物，每個(gè)PCR反應(yīng)含有12.5μL的2X Supermix RDQ，0.25μL的20X引物和探針，1.25μL的水。每次反應(yīng)的總初始體積為25μL，以上為15μL超級(jí)混合-引物-探針混合物和10μL水作為陰性對(duì)照。用5.0μL的CHO DNA和5.0μL的水作為標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本。用KAPA蛋白酶對(duì)樣品進(jìn)行酶解，不是從單克隆抗體樣本中提取hrDNA。將KAPA蛋白酶處理過(guò)的樣本作為PCR模板，進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 數(shù)字PCR定量單抗藥物CHO殘留DNA。

圖1 DS4P+K:單抗藥物+蛋白酶K;DS4P:單抗藥物;

DS4P+K+NDA：?jiǎn)慰顾幬?蛋白酶K+背景hrNDA;DS4P+NDA：?jiǎn)慰顾幬?背景hrNDA 單抗藥物沒(méi)有hrDNA

圖2 確定數(shù)字PCR檢測(cè)CHO hrDNA的動(dòng)態(tài)范圍和定量線(xiàn)。

五、結(jié)論

1. dPCR定量CHO細(xì)胞hrDNA具有更低的定量線(xiàn)和準(zhǔn)確性;

2. dPCR定量蛋白藥物中hrDNA不需要DNA抽提，只需要用蛋白酶K處理抗體藥物即可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。

參考文獻(xiàn)

Digital PCR Method for CHO Host Residual DNA Quantification in Biologic Drugs