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　　文章：Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods

　　Journal：Nature Biotechnology

　　IF： 39.080

　　文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-020-0465-8

　　一、單細(xì)胞測序的方法評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

　　1.the structure and alignment of reads to the nuclear and mitochondrial genomes(核和線粒體基因);

　　2.sensitivity in capturing RNA molecules(捕獲精度);

　　3.extent of multiplets (assessed in mixture experiments)(混合實(shí)驗(yàn)評估);

　　4.their technical precision/reproducibility with respect to expression estimates(重復(fù)性和精度);

　　5.the ability to recover meaningful biological distinctions in cell types (for PBMC and cortex experiments)(鑒定細(xì)胞類型的能力)

　　二、單細(xì)胞測序的方法評價(jià)實(shí)驗(yàn)方案

　　上述表格展示了本文的實(shí)驗(yàn)方案組合：分別采用三種不同類型的材料，每種材料包含2個(gè)重復(fù)，測試了其中單細(xì)胞測序的實(shí)驗(yàn)方法。其中低通量測序包含2種，5高通量的方法。

　　三、單細(xì)胞測序的方法評價(jià)材料選取

　　上述圖片展示了本實(shí)驗(yàn)的材料設(shè)置方案;分別對應(yīng)的人鼠細(xì)胞系的混合樣本，人類的外周血PBMC，小鼠大腦皮層的細(xì)胞核。

　　四、單細(xì)胞測序的方法的選取

　　上述圖片展示的文章用到的單細(xì)胞測序的實(shí)驗(yàn)方法：包含2種低通量的smart-seq和CEL-seq，5種高通量的10X Chromium、Drop-Seq、Seq-Well、inDrops、sci-RNA-seq 。

　　五、單細(xì)胞測序的方法評價(jià)體系的建立流程

　　上述展示了單細(xì)胞測序后的分析流程：首先建庫測序，得到Fastq文件，比對分析，統(tǒng)計(jì)UMI(每個(gè)細(xì)胞一個(gè)ID)獲取表達(dá)矩陣，質(zhì)控細(xì)胞，聚類分析，細(xì)胞類型注釋。

　　六、評價(jià)結(jié)果分析-UMI的分布統(tǒng)計(jì)

　　上述圖片展示6種方法，在兩種混合細(xì)胞測試下，分別檢測到的人類細(xì)胞系和小鼠的細(xì)胞系的UMI數(shù)目。其中，低通量的單細(xì)胞測序方法CEL-Seq2的數(shù)目較高，其他方法的水平較為一致。smart-seq測序原理有區(qū)別，不存在umi。

　　七、評價(jià)結(jié)果分析-基因數(shù)的分布統(tǒng)計(jì)

　　上述圖片展示7種方法，在兩種混合細(xì)胞系測試下，分別檢測到的人類細(xì)胞系和小鼠的細(xì)胞系的gene數(shù)目。其中，低通量的2種單細(xì)胞測序方法的數(shù)目較高，其他方法的水平較為一致。

　　八、評價(jià)結(jié)果分析-多細(xì)胞率的分布統(tǒng)計(jì)

　　上述圖片顯示的是兩種在混合細(xì)胞體系的實(shí)驗(yàn)組多細(xì)胞率的變化趨勢。結(jié)果顯示，smart-seq隨著細(xì)胞數(shù)目的增加而不斷增加的趨勢。sci-RNA-seq表現(xiàn)出不太穩(wěn)定，而其他方法的雙細(xì)胞率表現(xiàn)比較穩(wěn)定。

　　九、評價(jià)結(jié)果分析-各組分的細(xì)胞占比

　　上述圖片展示的結(jié)果顯示，低通量單細(xì)胞測序方法獲得的細(xì)胞類型的完整較高，而高通量單細(xì)胞測序顯示，10X方法得到的細(xì)胞類型的效果與低通量的單細(xì)胞測序得到的結(jié)果相當(dāng)。

　　十、評價(jià)結(jié)果分析-細(xì)胞類型完整性評估

　　上述圖展示的是通過AUC(機(jī)器學(xué)習(xí)模型評估指標(biāo))評估顯示，10X單細(xì)胞測序在獲取細(xì)胞分型的效果是最好的。

　　總結(jié)：

　　在低通量單細(xì)胞測序顯示的結(jié)果看，在深度上占據(jù)較高的優(yōu)勢，特別是單個(gè)細(xì)胞測的的基因數(shù)，但在細(xì)胞類型上，有一定的偏好性，存在不完整的可能性，分群評估顯示個(gè)別群體差異還是比較大的，通量上存在巨大差距。

　　高通量的測序方法對比顯示，10X在物種方法中表現(xiàn)的效果綜合評判是最佳的，主要體現(xiàn)在穩(wěn)定性，測序深度，細(xì)胞類型的完整度及擬合度都表現(xiàn)出較為好的效果。