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　　研究背景

　　自2020年8月16日以來，嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)在全球已感染超過2100萬人。SARS-CoV-2抗原檢測在識別活動性感染和監(jiān)測疾病進展方面具有潛力，但它們與PCR和血清學檢測相比仍尚不完善。

　　盡管逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測仍是診斷COVID-19的金標準，但它不能提供有關疾病進展的充分信息。在患者血清轉化或恢復后的數周內，RT-PCR檢測仍可給出陽性結果。血清學檢測可識別已產生免疫應答的個體，但不一定用于監(jiān)測疾病感染的早期階段。SARS-CoV-2抗原檢測可以補充PCR和血清學檢測，通過檢測生物液中的病毒抗原識別活躍感染或監(jiān)測疾病進展。定量且超敏感的SARS-CoV-2抗原檢測可檢測血液、唾液或NP拭子中的病毒抗原，并與血清學檢測相結合，可分析COVID-19從早期感染到血清轉化的進展。

　　研究方法

　　為了解決定量抗原檢測的需求，我們開發(fā)了S1、S1-S2胞外結構域(spike)和核衣殼(N)的超靈敏單分子陣列(Simoa) SARS-CoV-2抗原檢測方法。采用單分子陣列法(Simoa)定量檢測冠狀病毒病(COVID-19)患者血漿中SARS-CoV-2尖刺、S1亞基和核衣殼抗原。選擇64例COVID-19陽性患者、17例COVID-19陰性患者和34例大流行前患者的血漿。結合Simoa抗SARS-CoV-2血清學檢測，對39例COVID-19患者的272個縱向血漿樣本中31個SARS-CoV-2生物標志物的變化進行了量化。數據通過分層聚類分析，并與縱向RT-PCR檢測結果和臨床結果進行比較。

　　Simoa檢測是在HD-X分析儀(Quanterix)上按照制造商說明和前面描述的自動三步分析格式進行的。

　　研究結果

　　對于SARS-CoV-2抗原Simoa檢測，三種類型的熒光染料編碼磁珠，針對每種病毒抗原的抗體功能化，并與上文所述的血漿樣本孵育，用于Simoa的多重測量?！維ARS-CoV-2 Simoa抗原檢測結果為S1、spike和N抗原，檢出限分別為5pg/mL (0.07pmol/L)、70pg/mL (0.39pmol/L)和0.02pg/mL (0.4fmol/L)?！课覀儥z測了抗SARS-CoV-2免疫球蛋白(總IgA、IgM和IgG)，以確定病毒抗原與免疫球蛋白水平之間的相關性。

　　為了檢測血漿中是否存在病毒抗原，使用SARS-CoV-2 Simoa抗原檢測方法檢測COVID-19陽性患者的樣本中的S1、spike和N。這些患者經NP-RT-PCR檢測為COVID-19陽性，所有血漿樣本均在首次NP - RT-PCR檢測后10天內獲得。64例COVID-19陽性患者中有41例檢測到S1和N，我們確定他們?yōu)椴《究乖栃浴?/span>

　　為了解感染后抗原和免疫球蛋白水平如何隨時間變化，對COVID-19陽性患者進行了縱向研究，監(jiān)測39名住院患者的連續(xù)血漿樣本中的病毒抗原濃度(S1、spike和N)和免疫球蛋白水平(總IgA、IgM、IgG和IgG1- 4)，所有患者均經NP - RT-PCR診斷為COVID-19陽性。

　　病人出現抗體反應時，隨著時間的推移，血漿中的病毒抗原濃度下降，免疫球蛋白水平升高。大多數病毒抗原陽性患者出現了這種趨勢。一旦患者發(fā)生血清轉化，血漿免疫球蛋白水平達到穩(wěn)定狀態(tài)，通常無法檢測到病毒抗原濃度。所有患者在首次NP - RT-PCR陽性檢測后平均7±1天發(fā)生血清轉化，血清轉換后5±1天血漿抗原完全清除。

　　Simoa檢測的超敏感性提供了病毒抗原濃度的定量分辨率，使我們能夠測量抗體產生的最早階段，以詳細了解患者隨時間的反應。

　　聚類圖分析，以確定COVID-19陽性患者的抗原和免疫球蛋白水平是否可以區(qū)分所有患者的不同感染階段。聚類圖顯示了三個優(yōu)勢分支(圖3)。第一個分支：大部分早期時間點，觀察到高濃度的病毒抗原和低水平的抗體。第二個分支：觀察到抗原濃度進一步下降，IgG亞類IgG2和IgG4略有增加。第三分支：患者已經從血漿中清除了病毒抗原，抗體已經達到了他們的穩(wěn)定水平。

　　觀察到在這個隊列中的39例患者中，隨著時間的推移，IgG1和IgG3的血藥濃度出現了大幅度的增加。相比之下，IgG2和IgG4在背景水平上幾乎沒有變化。IgG1和IgG3都是IgG的亞類，主要對病毒抗原起反應并介導中和作用。根據這些測量結果可知，SARS-CoV-2的免疫系統(tǒng)IgG反應主要由IgG1和IgG3介導，這與之前的血清學研究一致。

　　血漿是一種很容易從住院患者獲得的生物液體，但在非臨床環(huán)境中更難獲得。相比之下，唾液是一種非侵入性生物液，更易于用于大規(guī)模檢測，對于監(jiān)測病毒抗原濃度以了解COVID-19(一種呼吸道疾病)的活躍病毒感染可能更有意義。他們檢測了17位患者的唾液樣本，這些患者采用了NP - RT-PCR檢測COVID-19。發(fā)現與健康唾液對照相比，11名COVID-19患者中有7人檢測到S1和N。與在血漿中觀察到的抗原和免疫球蛋白類似。

　　結論

　　Simoa提供了一個動態(tài)范圍，可以在四個數量級的濃度范圍內定量抗原。本文報道的SARS-CoV-2 Simoa抗原檢測方法是迄今為止首次在COVID-19陽性患者血漿中檢測到病毒抗原。這些數據表明，在COVID-19重癥病例中，血液中的SARS-CoV-2病毒抗原與疾病進展相關，這些測量為抗SARS-CoV-2抗體的產生和血漿中病毒抗原清除之間的負相關提供了直接證據，這為從住院開始到康復或死亡的病毒感染和免疫應答提供了獨特的視角。