欧美性爱视频一级_人妻中文在线_中文字幕熟妇色偷偷久久_真实国产乱子伦高清_欧美日韩亚洲动漫_羞羞视频网站高清在线观看_麻豆传媒在线网站观看播放_草莓视频最新APP官网下载_亚洲图片国产精品日韩_日本91一区二区不卡

Addgene是一個(gè)非盈利性全球質(zhì)粒共享信息庫(kù)，它負(fù)責(zé)保存和提供質(zhì)粒。今天給大家分享的內(nèi)容是關(guān)于Addgene為什么要放棄qPCR定量AAV，相反選擇精準(zhǔn)定量技術(shù)數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)。

自從Addgene開(kāi)始制備腺相關(guān)病毒AAV載體以來(lái)，一直在使用qPCR來(lái)評(píng)估AAV載體的物理滴度，但是該方法需要做大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能證實(shí)qPCR定量AAV載體的準(zhǔn)確性，甚至作者認(rèn)為可能需要重復(fù)10000次才能實(shí)現(xiàn)qPCR定量AAV的準(zhǔn)確性，所以Addgene選擇使用更精準(zhǔn)的dPCR定量方法。

一、qPCR技術(shù)定量AAV物理滴度

在深入研究dPCR之前，Addgene很長(zhǎng)一段時(shí)間都在使用qPCR定量AAV。qPCR定量AAV時(shí)，對(duì)病毒DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增和監(jiān)控，當(dāng)PCR完成后通過(guò)病毒DNA的閾值熒光和標(biāo)準(zhǔn)品的閾值熒光來(lái)分析結(jié)果。所以利用qPCR定量AAV需要一個(gè)已知病毒滴度的標(biāo)準(zhǔn)品AAV作為參考品，來(lái)評(píng)估未知樣本AAV的病毒滴度。

當(dāng)然了，如果qPCR可以完美地解決AAV定量問(wèn)題，在這里就不需要使用dPCR方法來(lái)定量AAV了。qPCR的一個(gè)問(wèn)題是，針對(duì)同一個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果很可能差2倍，這意味著，如果你用同樣的樣本建立兩個(gè)相同的檢測(cè)方法，最終效價(jià)可能是4x10¹² GC/mL 或8x10¹² GC/mL，這兩個(gè)結(jié)果都是有效的。這就是為什么AAV參考品的選擇是至關(guān)重要的，它可以幫您確定您的滴定度是否在預(yù)期范圍內(nèi)。

另外，我們發(fā)現(xiàn)，為qPCR繪制一條準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線是非常有挑戰(zhàn)的。一方便質(zhì)粒本身有超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)狀態(tài)，其定量結(jié)果各有差異，所以Addgene選擇使用了相對(duì)準(zhǔn)確的線性化質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。然而，即使標(biāo)準(zhǔn)品是準(zhǔn)確的，它仍然是不穩(wěn)定的，所以未知樣本的檢測(cè)仍然是不具有高的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

qPCR定量AAV面臨的挑戰(zhàn)：

需要標(biāo)準(zhǔn)品才能實(shí)現(xiàn)定量，并且準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)品的選擇具有很大挑戰(zhàn);

繪制一條準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很大挑戰(zhàn)，且浪費(fèi)人力;

qPCR定量AAV批次間的誤差較大，重復(fù)性不好;

然而數(shù)字PCR不需要標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，這意味著節(jié)省了客戶(hù)大量時(shí)間，并且還可以獲得很高的數(shù)據(jù)重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

Figure 1：qPCR定量AAV需要標(biāo)準(zhǔn)品(橘黃色)、NTC(紫色)、參考品(粉紅色)，并且每個(gè)稀釋都需要做重復(fù)。dPCR定量AAV只需要一個(gè)NTC(紫色)，不需要標(biāo)準(zhǔn)品(橘黃色)和參考品(粉紅色)，

二、dPCR技術(shù)定量AAV物理滴度

數(shù)字PCR技術(shù)被譽(yù)為第三代PCR技術(shù)，可以在不需要標(biāo)準(zhǔn)品的情況下通過(guò)數(shù)數(shù)的方法實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì)定量，具有數(shù)據(jù)穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、靈敏度高等特點(diǎn)。數(shù)字PCR是將PCR反應(yīng)液通過(guò)數(shù)字PCR儀器自動(dòng)分割成數(shù)萬(wàn)個(gè)微反應(yīng)，分割后有些微反應(yīng)含有DNA模板(記作“1”)，有些微反應(yīng)分區(qū)不含有目標(biāo)DNA(記作“0”)，PCR擴(kuò)增后熒光信號(hào)積累，通過(guò)數(shù)陽(yáng)性信號(hào)的方法，便可以知道核酸的拷貝數(shù)。在試劑情況中，數(shù)字PCR的“數(shù)數(shù)”是利用泊松分布統(tǒng)計(jì)計(jì)算出的核酸的絕對(duì)拷貝數(shù)，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

用dPCR滴定AAV的過(guò)程是從稀釋病毒開(kāi)始的。值得注意的是，dPCR的動(dòng)態(tài)范圍是每個(gè)反應(yīng)1到100,000個(gè)基因組拷貝(GC)。由于AAV的效價(jià)一般在10¹²到10¹³ GC/mL 之間，所以在將樣品添加到混合反應(yīng)也中之前，必須先對(duì)病毒進(jìn)行連續(xù)稀釋。在Addgene，我們通常在dPCR 板上裝3份稀釋液。由于滴度是未知的，每個(gè)稀釋?xiě)?yīng)在一個(gè)廣泛的滴度測(cè)定范圍內(nèi)。

稀釋后，將檢測(cè)樣本被轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的含有混合反應(yīng)液，其中包括引物、探針和dPCR反應(yīng)酶，buffer 混合液。

使用數(shù)字PCR儀器將反應(yīng)混合液自動(dòng)分割成10,000-20,000個(gè)微反應(yīng)分區(qū)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng) PCR 完成后，利用數(shù)字PCR閱讀器檢測(cè)每個(gè)微反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，發(fā)出熒光的微反應(yīng)單元(1納升左右)包含著被放大的目標(biāo)序列。在讀取所有微反應(yīng)之后，軟件輸出樣本熒光圖片(圖2)。一個(gè)干凈的dPCR應(yīng)該有一個(gè)明確的分離之間的陽(yáng)性(綠色)和陰性(灰色)微滴。無(wú)模板陰性對(duì)照應(yīng)該沒(méi)有陽(yáng)性信號(hào)。

三、dPCR定量AAV的優(yōu)勢(shì)

1. dPCR定量AAV解決了AAV產(chǎn)品批次誤差的問(wèn)題，可以保證批次間cv<10%.

2. dPCR不需要標(biāo)準(zhǔn)品，定量AAV具有更高的數(shù)據(jù)重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

3.至少完成200個(gè)AAV樣本/天

四、ClarityTM 數(shù)字PCR系統(tǒng)

利用毛細(xì)虹吸原理將混有目標(biāo)核酸的PCR反應(yīng)混合液，均勻且獨(dú)立的分散到8聯(lián)管芯片中實(shí)現(xiàn)分區(qū)，接著進(jìn)行芯片封閉，其后放入普通PCR儀器擴(kuò)增，擴(kuò)增后將八聯(lián)管芯片移至檢測(cè)系統(tǒng)中，進(jìn)行芯片的圖像收集和目的核酸的絕對(duì)定量計(jì)算。

Clarity^TM digital PCR system

Clarity^TM 數(shù)字PCR芯片分區(qū)原理：Clarity數(shù)字PCR采用毛細(xì)管組成的芯片實(shí)現(xiàn)樣本自動(dòng)分區(qū)，主要借助毛細(xì)管虹吸原理實(shí)現(xiàn)分區(qū)，每個(gè)分區(qū)大小一致，分區(qū)結(jié)果穩(wěn)定，數(shù)據(jù)重復(fù)性好。

Clarity^TM數(shù)字PCR優(yōu)勢(shì)

快速：96個(gè)反應(yīng)完成時(shí)間<4h

準(zhǔn)確：無(wú)交叉誤差，結(jié)果更準(zhǔn)確;

開(kāi)放：與大部分PCR儀和試劑兼容;

可回收：簡(jiǎn)單震蕩便可回收產(chǎn)物;

高通量：8h可完成近200個(gè)反應(yīng);

分區(qū)穩(wěn)定：采用管中芯片技術(shù)，分區(qū)更穩(wěn)定;

操作簡(jiǎn)單：無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員操作;

參考文獻(xiàn)：

1. Furuta-Hanawa, Birei, Teruhide Yamaguchi, and Eriko Uchida. "2D droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors." Human Gene Therapy ja (2019). PubMed PMID: 31140327. PubMed Central PMCID: PMC6707039.

2. Gobert, Guillaume, et al. "Droplet digital PCR improves absolute quantification of viable lactic acid bacteria in faecal samples." Journal of microbiological methods 148 (2018): 64-73. PubMed PMID: 29548643.

3. Lock, Martin, et al. "Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR." Human gene therapy methods 25.2 (2013): 115-125. PubMed PMID: 24328707. PubMed Central PMCID: PMC3991984.

4. Song, Neng, et al. "Detection of circulating Mycobacterium tuberculosis-specific DNA by droplet digital PCR for vaccine evaluation in challenged monkeys and TB diagnosis." Emerging microbes & infections 7.1 (2018): 1-9. PubMed PMID: 29691363. PubMed Central PMCID: PMC5915492.