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　　1、引言

　　癌癥治療的細(xì)胞療法，始于基因編輯過的免疫細(xì)胞。例如CAR-T細(xì)胞治療中，對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，以表達(dá)腫瘤特異性的CAR。作為目前最常用的基因編輯技術(shù)，CRISPR在各類研究中發(fā)現(xiàn)有望治療各類疾病，其中不乏癌癥。而基于T細(xì)胞的基因工程改造方法很多，不限于慢病毒，其中也包含CRISPR方法。

　　CRISPR-Cas9系統(tǒng)適用性廣，包括癌細(xì)胞、類器官和原代的免疫細(xì)胞均適用。

　　10X的Next Gem技術(shù)在凝膠珠中加入了Feature barcoding，能夠額外捕獲帶有標(biāo)記的抗體、配體、gRNA的核酸標(biāo)記。10X的解決方案能夠直接捕獲CRISPR擾動(dòng)，與傳統(tǒng)篩選方法相比，大約能快一倍的速度。

　　2、一個(gè)里程碑式的研究

　　美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)和斯坦福大學(xué)合作的一篇研究論文。文章開展了多重CRISPR基因編輯T細(xì)胞療法的第一個(gè)人體臨床一期實(shí)驗(yàn)，堪稱里程碑式的研究。

　　文章使用10X的單細(xì)胞技術(shù)作為前期質(zhì)控和后期監(jiān)測(cè)技術(shù)，監(jiān)控編輯了TCR序列的T細(xì)胞(TCR T細(xì)胞)的純度和功能。

　　2.1、文章的流程

　　(1)從受試者體內(nèi)提取出T細(xì)胞

　　(2)基因編輯T細(xì)胞，提高T細(xì)胞對(duì)于癌癥的殺傷性

　　(3)回輸?shù)绞茉囌唧w內(nèi)

　　文章做了4個(gè)基因編輯：敲除了TRA、TRB(內(nèi)源性T細(xì)胞受體的α、β基因)和PD-1，敲入了NY-ESO-1(一種腫瘤特異性TCR)。使用5’RNA測(cè)序，檢測(cè)了T細(xì)胞的比例、表形以及隨時(shí)間的演變。

　　2.2、整個(gè)流程有幾個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)需要考察

　　(1)回輸前要對(duì)工程T細(xì)胞進(jìn)行表征，確認(rèn)基因編輯后的T細(xì)胞是否真的有想要的基因編輯內(nèi)容;

　　(2)回輸前后，各種TCR-T細(xì)胞的比例和持續(xù)時(shí)間;

　　(3)單細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)譜是如何變化的;

　　(4)受試者的免疫系統(tǒng)對(duì)TCR-T細(xì)胞有何響應(yīng)。

　　2.3、單細(xì)胞測(cè)序能夠?qū)σ陨蠁栴}進(jìn)行回答

　　韋恩圖和堆積柱狀圖中可以看到各種TCR-T細(xì)胞的種類和比例

　　折線圖和UMAP可以展示不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)樣本進(jìn)行單細(xì)胞分析的結(jié)果、評(píng)估體內(nèi)持久性、評(píng)估持續(xù)性CAR-T細(xì)胞的表型

　　B圖可以證明，從血液中分離的細(xì)胞能夠直接進(jìn)行單細(xì)胞研究。被編輯的T細(xì)胞在回輸人體后數(shù)量會(huì)下降，然后達(dá)到穩(wěn)定，尤其是藍(lán)色的NY-ESO-1 TCR-T細(xì)胞幾乎沒有變化，說明在該實(shí)驗(yàn)條件下的基因工程T細(xì)胞免疫原性非常小、基因編輯T細(xì)胞用于免疫治療也是可行的。

　　D圖展示了不同時(shí)間點(diǎn)NY-ESO-1 TCR-T細(xì)胞的基因表達(dá)UMAP圖。其中TCF7的表達(dá)隨著時(shí)間增加而增加，表明NY-ESO-1 TCR-T細(xì)胞是記憶型表型，而不是耗盡型表型。這說明TCR-T細(xì)胞有望在患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在。

　　3、優(yōu)勢(shì)

　　優(yōu)勢(shì)1：更快的周轉(zhuǎn)時(shí)間

　　單細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在流程中轉(zhuǎn)導(dǎo)之后的過程，將原本的2周時(shí)間縮短為3天。同時(shí)深度測(cè)序變?yōu)檗D(zhuǎn)錄組測(cè)序。

　　傳統(tǒng)的方法在轉(zhuǎn)導(dǎo)后會(huì)使用不同條件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇，篩選出帶有g(shù)RNA的細(xì)胞，同時(shí)還必須做一組平行陰性。接著需要做表型的評(píng)估、PCR擴(kuò)增以及深度測(cè)序。

　　轉(zhuǎn)導(dǎo)后2-3天就可以開始10X單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，來評(píng)估CRISPR擾動(dòng)帶來的影響，而且是原代細(xì)胞的評(píng)估。測(cè)序方面，因?yàn)槭氰b定gRNA帶有的barcode，因此不需要深度測(cè)序。5k raw reads/cell就可以識(shí)別gRNA帶有的barcode。

　　優(yōu)勢(shì)2：更大的擴(kuò)展性

　　傳統(tǒng)方法篩選需要多個(gè)平臺(tái)共同協(xié)作，人工需求大，工作繁瑣。而且針對(duì)的是總體的表型，比如說細(xì)胞形狀、生存率、增殖和耐藥性等;

　　而單細(xì)胞測(cè)序只需要一個(gè)單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，而且是自動(dòng)化操作、人工需求少。能夠獲得單細(xì)胞分辨率的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。同時(shí)，10X提供的8通道芯片可以并行做8個(gè)實(shí)驗(yàn)?？梢允峭粊碓?，8個(gè)不同CRISPR編輯結(jié)果的T細(xì)胞文庫;也可以是同一種編輯的8個(gè)不同來源的細(xì)胞文庫。因此在實(shí)驗(yàn)拓展性上更為精細(xì)。

　　總體而言：?jiǎn)渭?xì)胞技術(shù)進(jìn)行CRISPR工程T細(xì)胞篩選，具有更快的速度、更高的分辨率更精細(xì)的表征、更小的批次效應(yīng)、更大的實(shí)驗(yàn)規(guī)模、多重和混合檢測(cè)能力。