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　　CD19特異性嵌合抗原受體CAR-T細(xì)胞的免疫治療在復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞癌中顯示出了卓越的療效。CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增和持續(xù)注射是決定反應(yīng)和毒性的重要變量，但目前沒有一種精準(zhǔn)的診斷工具監(jiān)控Car-T細(xì)胞代謝情況。研究表明，數(shù)字PCR (dPCR)非常適合于在體內(nèi)監(jiān)測CAR-T細(xì)胞。本文作者開發(fā)一種dPCR檢測方法，克隆并測序了從慢病毒tisa-cel載體、axis-cel載體中構(gòu)建的CAR，并設(shè)計了引物和BHQ探針，比較axis-cel (A)、tisa-cel (T)和兩種載體通用(U =“通用”)的FMC63 scFv引物探針檢測效果。

　　Car-T細(xì)胞治療在血液瘤中表現(xiàn)甚佳，靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在難治性晚期B細(xì)胞惡性腫瘤中表現(xiàn)出卓越的療效。除了血液瘤之外，目前許多臨床實驗將Car-T細(xì)胞療法應(yīng)用于實體瘤。兩種CD19-CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品(Tisagenlecleucel/tisa-cel/Kymriah和Axicabtagene ciloleucel/ axis -cel/Yescarta)已經(jīng)在許多國家獲得許可。

　　一些報告已經(jīng)證明了利用Axi-cel治療后，CAR-T細(xì)胞的植入、擴(kuò)張和體內(nèi)持久性對細(xì)胞治療后的臨床結(jié)果的重要性。在前28天，CAR-T細(xì)胞峰值濃度和曲線下面積(AUC)值與長期療效相關(guān)，相反，在急性和慢性B細(xì)胞白血病(分別是B-ALL和B-CLL)中，沒有報告、Tisa-cel的AUC和療效之間的關(guān)聯(lián)(是測定μg DNA的載體拷貝數(shù)而不是每μl血液的實際CAR-T細(xì)胞數(shù)量)。此外，兩項細(xì)胞研究都發(fā)現(xiàn)了臨床反應(yīng)和組織細(xì)胞在外周血中的持久性之間的直接聯(lián)系?？傊?，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了可靠和準(zhǔn)確地定量CAR-T細(xì)胞的重要性，以獲得可靠的真實數(shù)據(jù)的兩個批準(zhǔn)的產(chǎn)品。不幸的是，在很大程度上缺少精確和快速的分析方法。

　　數(shù)字PCR (dPCR)的原理在20世紀(jì)90年代早期就有了描述，但該技術(shù)直到近十年才得到廣泛應(yīng)用，這得益于易于使用的dPCR設(shè)備的引入。簡而言之，通過將一個聚合酶鏈反應(yīng)分割成大量的個體聚合酶鏈反應(yīng)(例如，20,000個或者15,000個)，數(shù)字PCR使用了有限稀釋原理，即將PCR反應(yīng)分割為數(shù)萬個獨立的個體PCR反應(yīng)，分割后的結(jié)果是要么包含PCR目標(biāo)序列(記為“1”)，要么不包含它(記為“0”)。與定量PCR一樣，目的序列的擴(kuò)增是基于熒光檢測的，但這是在每個分區(qū)單獨進(jìn)行;應(yīng)用泊松校正計算給定樣本中目標(biāo)副本的絕對數(shù)量。根據(jù)熒光通道的數(shù)量，可以對單個樣品進(jìn)行兩個甚至更多重檢測。dPCR的靈敏度、特異性和重復(fù)性極佳，使得該方法特別適用于罕見事件的精確定量。

　　作者開發(fā)了一種dPCR檢測方法，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地定量各種體液中axi-cel CAR-T細(xì)胞。在這里描述了新型dPCR的開發(fā)、測試和臨床應(yīng)用，包括一種檢測源自小鼠抗人CD19抗體FMC63單鏈片段原始序列的方法。FMC63針對CD19基因第4外顯子中的CD19特異性表位。我們發(fā)現(xiàn)這種新型的dPCR在定量axi-cel Car-T細(xì)胞和tisa-cel CAR-T細(xì)胞方面表現(xiàn)優(yōu)異。

　　實驗結(jié)果

　　測序確定axi-cel和tisa-cel Car-T全長序列，設(shè)計特異性引物探針

　　兩種載體構(gòu)建(tisa-cel和axis-cel)中使用的CAR cDNA方案。相同的序列用淺灰色表示，不同的序列用深灰色表示(Sig =信號肽)。在axis-cel CAR中，使用CD28共刺激域，而不是如圖所示的4-1BB域。CD3ζ域因一個點突變而不同，用星號表示(詳情見正文)。tisa-cel (T)和axis-cel (A)特異性擴(kuò)增子/引物的定位如圖中灰色箭頭所示，而通用(U)引物的定位如圖中黑色箭頭所示。

　　在2D圖中極好地分離了陰性和陽性信號， (y軸:CAR-specific信號，x軸:HCK參考(REF)信號)。

　　用通用引物檢測axi-cel產(chǎn)品并進(jìn)行梯度稀釋

　　鑒定axi-cel和tisa-cel Car-T引物探針的特異性、靈敏度和重復(fù)性

　　用axi-cel Car-T引物探針檢測患者Car拷貝數(shù)

　　通過先前報道的axi-cel(axi-Old)試驗與新的fmc63定向axi-cel(A)和通用(U)試驗進(jìn)行評估。實驗證明，所有三種檢測的結(jié)果基本上是相同的。

　　CAR-T細(xì)胞在axi-cel治療#015患者的動力學(xué)

　　比較dPCR和流式細(xì)胞技術(shù)的相關(guān)性

　　對于兩名兒童患者，采用流式細(xì)胞術(shù)獨立的、盲法分析。圖4顯示了這兩名兒童tisa-cel患者采用通用檢測方法獲得的流式細(xì)胞術(shù)和dPCR數(shù)據(jù)(#020，#027，見表2)。顯然，兩種不同方法測定的CAR-T細(xì)胞數(shù)量在大多數(shù)情況下，dPCR測定的值略高。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了該通用檢測方法對tisa-cel治療患者隨訪的有效性。

　　結(jié)論

　　“通用”數(shù)字PCR方法非常適合于高靈敏度、精確和重復(fù)性的tisa-cel和axi-cel CAR-T細(xì)胞檢測。使用每μl體液中CAR-T細(xì)胞的實際數(shù)量可以精準(zhǔn)定量體液中Car-T細(xì)胞，密切監(jiān)測CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的數(shù)量對于指導(dǎo)患者的后續(xù)干預(yù)至關(guān)重要。

　　參考文獻(xiàn)：

　　Accurate In-Vivo Quantification of CD19 CAR-T Cells after Treatment with Axicabtagene Ciloleucel (Axi-Cel) and Tisagenlecleucel (Tisa-Cel) Using Digital PCR